超臨界流体クロマトグラフィー（Supercritical Fluid Chromatography)とは、気体の圧力を臨界点以上に保ち、移動相を超臨界流体にしたクロマトグラフィーのことをいいます。
超臨界流体クロマトグラフィーの固定相には固体または液体を結合させたものを使用します。
HPLCは高速液体クロマトグラフィーのことで、微量試料の分析をすることが可能な液体クロマトグラフィーです。
ＨＰＬＣの主な構造は、高圧力の送液が可能なポンプ、固定相が入っているカラム、検出器からなります。ＨＰＬＣは固相-液相、または液相-液相の相互作用で行われ、以下のような分離方法があります。
１．吸着クロマトグラフィー
２．分配クロマトグラフィー
３．イオン交換クロマトグラフィー
４．サイズ除去クロマトグラフィー
アルミナはシリカゲルと同じく広汎に使用されている吸着剤です。
アルミナでは塩基性（ph10)、中性（pH7.5)、酸性（pH4)のタイプの吸着剤があり、飽和脂肪族炭化水素以外の有機化合物ではほとんど吸着されます。
酸性アルミナではアミノ酸、酸性ペプチドの分離などに使用され、中性アルミナではラクトン、エステル、ケトステロイドなどに、塩基性アルミナでは極性の高い化合物に使用できます。
シリカゲルカラムは極性の大きい吸着剤であるため、無極性の分子より極性物質を強くひきつけます。
そのためシリカゲルカラムの場合、溶媒の極性が強いほど溶質は早く流出します。ただ、pH8以上の溶媒に対しては溶解してしまうので用いることはできません。
ODSカラムとはアルキル基が炭素数18であるカラムのことで、octadecyl silaneの略です。分配クロマトグラフィーに使用されるカラムであり、水100%からメタノール100%まで使うことができる一般的なカラムです。
そのため、試料には極性の高い物質や脂肪族炭化水素なども分離することが可能です。
分配クロマトグラフィーとは、担体粒子表面の膜状液相と移動相との分配平衡を利用して、成分を分離する方法です。
分配クロマトグラフィーでは固定相液体（担体粒子表面の膜状液相）に対して溶解度が大きい物質ほど遅れて溶出します。
ＨＰＬＣでは逆相モードが一般的です。逆相のＨＰＬＣでは移動相に水100％からメタノールやアセトニトリルを用いることができるため、水に溶ける極性物質や脂肪族炭化水素などを分離させることが可能です。
内部標準法は検量線を作成しようとしても、検出機器の出力が測定時の条件に依存して、変動するような場合に利用する方法です。
具体的には一定濃度に決めた内部標準物質を検量線に使用する標準試料と共に添加して、標準試料の信号と内部標準物質の信号の比をとります。この相対的な比と標準試料の濃度との関係を検量線にします。
そのため、内部標準は標準試料と似たような特性を持つ物質にする必要があります。
検量線の求め方は、何段階かの濃度の試料を用意（ブランクも用意する）して、その各濃度に対する検出器の出力結果との関係を回帰分析して検量線を求めます。
この検量線を利用すると、未知試料の濃度を求めることができます。なお、検量線は直線性が高いほど正確であり、検量線の傾きは感度を表します。
分取HPLCでは分析用のHPLCと比べて大口径カラムと10ml〜20ml/分程度の溶媒処理量を必要とします。カラムから流出した成分はフラクションコレクターで分画されるのが一般的です。
分取できるほどの成分を検出するため、分析HPLCほど感度が高い検出器である必要はありません。そそして検出器には示差屈折率検出器が適しており、UV検出器も適用できますがUV検出器の場合は検出器の容量を超えることに注意する必要があります。
示差屈折率検出器とは、溶離するときに使われる「溶媒」の屈折率と「測定成分＋溶媒」の屈折率の差を検出するという装置です。
そのため、溶媒と測定成分（溶質）の屈折率に差があれば検出することができますので、汎用性があります。
ただし、温度や溶離液などによって検出感度に影響を受けやすく、他の検出器と比べて感度も低いという欠点もあります。
Rf値の計算方法は以下のようになります。
Rf（相対移動距離）＝原線から成分のスポット中心までの距離/原線から溶媒先端までの距離
TLCのプレートの端に試料混合物を滴下したあとに、移動相の入った密閉容器に浸して展開させると、移動相は毛細管現象によってプレートの上部へ移動していきます。
そして、溶媒が上端近くに達したときの部分に印を付けて、成分スポットの位置にも印を付けます。この印を付けた位置までの移動距離から相対移動距離（Rf値）を求めます。
Rf値は再現性が良くないため、再現性を確認するためには以下の点に注意する必要があります。
１．必ず同じ市販の製品のTLCを用いる
２．展開するまでの時間は標準化しておき、できるだけ短くする
３．展開する前に展開層の中は溶媒蒸気で飽和させておく
４．何度か繰り返し行って平均値を求める
脈流ポンプとは、加圧下で溶媒をカラムに送るために、往復ピストンなどを利用している定流量ポンプです。このポンプは血管が脈打つ感じで液体が流れるために脈流ポンプと呼ばれており、HPLCではできるだけこの脈流をなくすことが大切です。
]]> HPLCのポンプ
HPLCのポンプは0.01ml〜1.0ml/分または0.1ml〜20ml/分の定流量ポンプで、脈流がないものが必要です。
脈流ポンプに対しては、脈流を緩和させる対策としてポンプヘッドを複数付けたり、ポンプとカラムの間に脈流ダンパーを取り付けるなどの対策があります。
検量線の求め方は、何段階かの濃度の試料を用意（ブランクも用意する）して、その各濃度に対する検出器の出力結果との関係を回帰分析して検量線を求めます。
この検量線を利用すると、未知試料の濃度を求めることができます。なお、検量線は直線性が高いほど正確であり、検量線の傾きは感度を表します。
HPLCは高速液体クロマトグラフィーのことで、微量試料の分析をすることが可能な液体クロマトグラフィーです。
ＨＰＬＣの主な構造は、高圧力の送液が可能なポンプ、固定相が入っているカラム、検出器からなります。ＨＰＬＣは固相-液相、または液相-液相の相互作用で行われ、以下のような分離方法があります。
１．吸着クロマトグラフィー
２．分配クロマトグラフィー
３．イオン交換クロマトグラフィー
４．サイズ除去クロマトグラフィー
薄層クロマトグラフィー（TLC）ではガラス板に微粒子（シリカゲル、アルミナ、セルロース末など）を塗布している薄層（0.1〜2mm)で、平面クロマトグラフィーの1つです。
薄層クロマトグラフィー（TLC）の使い方は、プレートの端に試料混合物を滴下したあとに、移動相の入った密閉容器に浸して展開させます。
TLCのプレートの端に試料混合物を滴下したあとに、移動相の入った密閉容器に浸して展開させると、移動相は毛細管現象によってプレートの上部へ移動していきます。
そして、溶媒が上端近くに達したときの部分に印を付けて、成分スポットの位置にも印を付けます。
この印を付けた位置までの移動距離から以下のように相対移動距離（Rf値）を求めます。
Rf（相対移動距離）＝原線から成分のスポット中心までの距離/原線から溶媒先端までの距離
フラッシュクロマトグラフィーとは吸着剤を太くて短いカラムに充填し、移動相溶媒を空気圧の力によって加圧送液する分離方法です。
加圧送液するため、吸着剤の粒径は40μ〜60μmのものが用いられます。試料のTLCにおけるRf値が0.35になるような展開溶媒がフラッシュクロマトグラフィーでは良好な分離結果をもたらすといわれています。
HPLCは高速液体クロマトグラフィーのことで、微量試料の分析をすることが可能な液体クロマトグラフィーです。
ＨＰＬＣの主な構造は、高圧力の送液が可能なポンプ、固定相が入っているカラム、検出器からなります。ＨＰＬＣは固相-液相、または液相-液相の相互作用で行われ、以下のような分離方法があります。
１．吸着クロマトグラフィー
２．分配クロマトグラフィー
３．イオン交換クロマトグラフィー
４．サイズ除去クロマトグラフィー
疎水性クロマトグラフィーとは、タンパク質とゲルに結合したリガンド間の疎水的相互作用を利用して分離するクロマトグラフィーのことです。
疎水性クロマトグラフィーには、疎水性部分−疎水性基間の結合を利用した吸着クロマトグラフィーと逆相系のような分配型クロマトグラフィーに分けられます。
疎水性基をもつゲルを充填させたカラムは、タンパク質や酵素の分離に適しています。タンパク質試料を親水性移動相で溶出すると、タンパク質表面の疎水性部分と担体上の疎水性基間の結合力の弱いものから流出します。（疎水相互作用クロマトグラフィー：HIC）
疎水クロマトグラフィーのなかでも分配クロマトグラフィ型は、移動相が極性有機溶媒、固定相が長鎖の無極性リガンドで、両相間で溶質の分配が行われます。このタイプはHPLCでよく用いられます。
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シリカゲルカラムは極性の大きい吸着剤であるため、無極性の分子より極性物質を強くひきつけます。
そのためシリカゲルカラムの場合、溶媒の極性が強いほど溶質は早く流出します。ただ、pH8以上の溶媒に対しては溶解してしまうので用いることはできません。
シリカゲルカラムを用いたクラロマトグラフィーで使用される溶媒の極性について、極性が強いものから並べてみました。
水＞メタノール＞アセトニトリル＞エタノール＞n-プロピルアルコール＞アセトン＞酢酸エチル＞エチルエーテル＞クロロホルム＞テトラヒドラフラン＞塩化メチレン＞トルエン＞ベンゼン＞四塩化炭素＞シクロヘキサン＞炭化水素
イオンクロマトグラフィーではイオン交換カラムを用いて試料中のカチオンまたはアニオンとイオン交換して分離を行います。
イオン交換カラムの充填剤についてはプラスイオンまたはマイナスイオン専用であり、両イオンを持つものはありません。そのため両イオンを分析するためには、カラムを交換する必要があります。
イオン交換クロマトグラフィーに用いられる検出器は電気伝導度検出器が用いられます。
電気伝導度検出器とは、イオン性の溶質の測定に用いられる検出器で、溶質イオンによって上昇する溶離液の導電率を利用しています
グラジエント法：できません。
直線関係の成り立つ範囲の上限：10-3
直線域（最大値）：2×104
試料に対する感度：10-8g/ml
流速に対する影響：有り
温度に対する影響：2%/℃
ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の1つであり、有機溶媒を用いたSECをゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）と呼び、水性溶媒を用いたSECをゲルろ過クロマトグラフィーと呼びます。
ゲル浸透クロマトグラフィーは、溶質の分子の立体的な大きさに基づき"ふるい"にかけて分離する方法で、架橋ポリスチレンゲルなどの耐圧性多孔質粒子を用いて、その粒子の分子量の大きさによって分離が行われます。
そのため、ゲルの細孔より小さい物質は、ゲルの中に浸透しやすくなるため溶出が遅くなり、ゲルの細孔より大きな物質はゲルの中に浸透しにくいため、溶出が早くなります。
ゲル浸透クロマトグラフィーでは保持容量（Ｖ）と試料分子の分子量（Ｍ）の対数に直線関係が成り立ちます。そのため、分子量がわかっている物質で検量線を作ることで、未知の物質の分子量をおおよそ推定することができます。
クロマトグラムに関しては単一なピークまたはブロードなピークの集合がみられます。
ゲルろ過クロマトグラフィー（GFC）はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の1つであり、水性溶媒を用いたSECをゲルろ過クロマトグラフィーと呼び、有機溶媒を用いたSECをゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）と呼びます。
SECはカラム充填剤にポリスチレンゲルや親水性ポリマーなどの耐圧性多孔質粒子を用いて、その粒子の分子量の大きさによって分離が行われます。
そのため、ゲルの細孔より小さい物質は、ゲルの中に浸透しやすくなるため溶出が遅くなり、ゲルの細孔より大きな物質はゲルの中に浸透しにくいため、溶出が早くなります。
ゲルろ過クロマトグラフィーでは保持容量（Ｖ）と試料分子の分子量（Ｍ）の対数に直線関係が成り立ちます。そのため、分子量がわかっている物質で検量線を作ることで、未知の物質の分子量をおおよそ推定することができます。
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